当前位置：首页 - 正文

干货| qPCR实验中,怎么确定cDNA的稀释梯度呢?

发布网友发布时间：2024-10-23 12:11

我来回答

共1个回答

热心网友时间：2天前

在qPCR实验中，决定cDNA稀释梯度的关键在于确保实验的准确性和可重复性。以下是两种常见的cDNA投入策略及其可能遇到的问题：

1. 依赖实验室传统稀释倍数：这种方法可能基于前人经验，但忽略了不同RNA样本表达量的差异。如果样本表达量低，而按照高表达样本的稀释比例，可能导致扩增效果不佳甚至无效。

2. 使用NanoDrop测定浓度：尽管可以提供浓度信息，但紫外吸收法对溶液的pH和盐浓度敏感，cDNA中的杂质可能影响测量结果。未纯化的cDNA含有多种杂质，这使得直接测定浓度不准确。

为了准确确定cDNA稀释梯度，以下是两种方法：

方法一：做梯度稀释，通过qPCR找出15-33 CT值范围内的最佳稀释度。例如，对GAPDH内参基因进行10倍稀释，选择使CT值在15-33之间的稀释梯度。
方法二：针对未知体系，先用原液测CT值，通过调整稀释倍数使目标CT值达到预期。例如，若GAPDH原液CT=10，需稀释1024倍以达到20 CT值。

极端情况下，可以对目的基因和内参基因分别选择不同的稀释梯度，以兼顾高表达和低表达。但要注意，稀释梯度的不一致在相对定量计算中会被自动抵消，前提是内参基因和目的基因在所有组别中使用相同的稀释梯度。

综上，确保cDNA稀释梯度的准确性是qPCR实验成功的关键步骤，通过科学的方法和设备选择，可以大大提高实验结果的可靠性。

声明：本网页内容为用户发布，旨在传播知识，不代表本网认同其观点，若有侵权等问题请及时与本网联系，我们将在第一时间删除处理。
E-MAIL:11247931@qq.com

焦点

干货| qPCR实验中,怎么确定cDNA的稀释梯度呢?

最新推荐

猜你喜欢

热门推荐