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发布时间：2024-09-27 09:52
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时间：2024-10-31 02:06
在RNA定量领域，多种方法并存，如Ribogreen、Agilent BioAnalyser、spectrophotometer、Nanodrop和BioRad Experion。一项比较研究显示，这些方法对同一样本的分析结果并不一致，因此，选择不同的方法进行定量并不理想。为了保证RNA样品的质量评价，我们需要建立统一的定量分析体系。
RNA质量评估关键在于纯度和完整性，传统方法通过A260/A280比值和琼脂糖凝胶电泳分析rRNA带。微流体毛细电泳系统如Agilent Bioanalyser和BioRad Experion提供了新的视角，如通过18S和28S rRNA图谱分析RNA量和完整性，以RIN（完整性系数）衡量，范围在10-4，数值越高，RNA越完整。然而，这些方法可能仅间接反映mRNA完整性，因此推荐采用GAPDH的3’：5’分析法，通过oligo dT逆转录和荧光定量PCR，设计探针检测三种等长扩增产物的比值，以反映RNA完整性。
在进行QRT-PCR时，抑制物对实验结果影响极大，可能导致灵敏度下降和假阴性。抑制物可能源于样品提取、共沉淀、盐离子、尿素等。评估抑制物的方法包括：通过样品梯度稀释检测PCR效率，使用内部对照反应样本处理效果，检测临床样品中的细菌，以及使用人工合成的扩增物检查目标检测物的抑制情况。
反转录反应系统的选择也至关重要，有单一酶系统、分离酶系统和不同引物的应用。引物类型包括：随机引物（推荐使用15nt），适合大部分靶位点但对特定变异体和长3’UTR区有局限；oligo-dT适合含有polyA的mRNA完整样本，但对特定情况可能有困难；而特异引物在RNA量充足时最精确且灵敏，是最优选择。
定量PCR（Polymerase Chain Reaction）技术有广义概念和狭义概念。广义概念的定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。狭义概念的定量PCR技术（严格意义的定量PCR技术）是指用外标法（荧光杂交探针保证特异性）通过监测PCR过程（监测扩增效率）达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对照有效排除假阴性结果（扩增效率为零）。
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