免疫共沉淀的细胞刮子为什么要埋冰下？
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发布时间：2022-04-22 00:29
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时间：2024-01-16 15:38
免疫共沉淀技术路线 准备工作 预冷PBS RIPA Buffer 细胞刮子（用保鲜膜包好后 埋冰下）离心机 1.用预冷的PBS洗涤细胞两次 最后一次吸干PBS 2.加入预冷的RIPABuffer（1ml/107个细胞 10cm培养皿或150cm2 培养瓶 0.5ml/5x106个细胞 6cm培养皿 75cm2培养瓶）3.用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下 把悬液转到1.5EP管中 4·C 缓慢动15皿（EP管插冰上 置水平摇床上）4.4·C 14000g离心15min 立即将上清转移到一个新的离心管中5.准备Protein Aagarose（琼脂糖珠）用PBS洗两遍珠子 然后用PBS配制成50%浓度 建议减掉*尖部分 避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠 6.每1ml总蛋白中加入100ulProteinA琼脂糖珠（50%）4·C摇晃10皿（EP管插冰上 置水平摇床上）以去除非特异性杂蛋白 降低背景7.4·C 14000g离心15min 将上清转移到一个新的离心管中 去除ProteinA珠子（Bradford法）做蛋白标准曲线 测定蛋白浓度 测前将总蛋白至少稀释1: 10倍以上 以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量 分装后 可以在-20·C保存一个月）
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