设计PCR引物的主要原则是什么?
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发布时间:2022-04-19 17:42
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时间:2022-07-12 23:20
pcr的技术的主要步骤及pcr引物设计的一般原则分述如下:
1、pcr的技术的主要步骤:
①dna变性:(90℃-96℃):双链dna模板在热作用下,氢键断裂,形成单链dna
②退火:(60℃-65℃):系统温度降低,引物与dna模板结合,形成局部双链。
③延伸:(70℃-75℃):在taq酶(在72℃左右,活性最佳)的作用下,以dntp为原料,从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸,合成与模板互补的dna链。
每一循环经过变性、退火和延伸,dna含量即增加一倍。如图所示:现在有些pcr因为扩增区很短,即使taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成,因此可以改为两步法,即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行,以减少一次升降温过程,提高了反应速度。
2、引物设计的基本原则
①引物长度:15-30bp,常用为20bp左右。
②引物碱基:g+c含量以40-60%为宜,g+c太少扩增效果不佳,g+c
过多易出现非特异条带。atgc最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。
③引物内部不应出现互补序列。
④两个引物之间不应存在互补序列,尤其是避免3
′端的互补重叠。
⑤引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%,引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列,否则易导致非特异性扩增。
⑥引物3‘端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,最佳选择是g和c。
⑦引物的5
′端可以修饰。如附加*酶位点,引入突变位点,用生物素、荧光物质、地高辛标记,加入其它短序列,包括起始密码子、终止密码子等。