DNA pull down 实验
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发布时间：2022-11-28 23:22
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时间：2023-10-24 18:23
原理：
DNA pull down 是一种研究DNA与蛋白互作的方法。其原理是：生物素标记的DNA 片段结合在链霉亲和素磁珠上，再与核蛋白孵育，从而捕获并纯化出与DNA 片段互作的蛋白。捕获的蛋白一方面可以通过Western blot验证某一特定蛋白是否与靶DNA 片段结合；另一方面也可以进行质谱鉴定，筛选出与DN*段可能互作的蛋白质。
操作步骤：
1.探针制备：
a.对于研究的启动子靶标区域比较明确，且长度较短的DN*段，可以直接合成并标记上生物素作为pull down探针。
b.对于研究的启动子靶标区域没具体预测区域，一般针对基因上游2000bp序列设计引物，并标记上生物素；然后通过 PCR 扩增的方式钓取基因上游2000bp序列，回收纯化后作为DNA pull down的探针。
2.样本前处理
a. 用 1ml Cell lysis buffer重悬（10^7细胞）;冰上孵育10min，（5000g，4°，5min）离心，弃上清。
b. 加入2/3细胞体积的 Buffer B 悬浮细胞，超声5s裂解细胞。4℃，10,400× g for 5 min离心5min；取上清。
c. 用Buffer D稀释步骤b的上清液，-80℃冻存备用
3.Dynabead™ MyOne™ 链霉素亲和素 C1预处理：
a. 涡旋震荡磁珠40s，混匀磁珠
b. 分装60ul磁珠的1.5mL离心管中；
c. 磁力架上放置1min，弃上清；
d. 用1mL1X B&W Buffer洗涤磁珠3遍;
e. 用60ul 2X B&W Buffer悬浮磁珠；
f. 加入60 pmol生物素标记DNA（1ug）;室温颠倒孵育 15 min;
g. 磁力架上放置3min,去上清
h. 用60 μL 1X B&W Buffer洗涤3遍；
i. 用60ul 1× B/W buffer（ without NaCl）洗涤一遍
4.DNA pull down
a.制备binding reaction：加入100 µL 5× EMSA buffer 及包含100 µg 核蛋白 的上清液 ；补水至 500 µL.
b. 加500ul binding reaction到磁珠中；常温翻转20min
c.磁力架上放置1min，弃上清；
d.用wash buffer 洗涤3遍。
e.回收产物，进行后续WB验证或质谱鉴定。
PS:下边是如期生物DNA pull 项目手册，欢迎各位老师合作交流哈
